Verifizierung von neuen molekularen Markern für die Frühdiagnose von Lungentumoren zum Nutzen der nachgehenden Vorsorge (PURE-Lunge Verifizierung)

Status:

abgeschlossen 12/2020

Zielsetzung:

Im Vorgängerprojekt (FP‐339) wurden zahlreiche vielversprechende Markerkandidaten zur Früherkennung von Lungentumoren identifiziert. Im aktuellen Projekt sollten diese Kandidaten in einem unabhängigen Personenkollektiv aus der Region Bonn/Rhein‐Sieg verifiziert werden. Dabei sollte das bisherige Markerspektrum von epigenetischen Markern und Proteinen um genomische und RNA‐basierte Marker erweitert werden. Die bereits im Vorgängerprojekt etablierte spektrale Histopathologie sollte methodisch verbessert werden, um eine genauere Gewebeklassifizierung zu erzielen, sowie per Lasermikrodissektion Gewebeproben für die weitere molekulare Charakterisierung bereitstellen. Zusätzlich zur Rekrutierung von 400 Patientinnen und Patienten mit Verdacht auf Lungentumor sollten in einer nachträglichen Fragestellung zudem eine weitere Vergleichsgruppe von 100 Patientinnen und Patienten mit anderen, gutartigen Erkrankungen der Atemwege ("COPD‐Kontrollen") eingeschlossen werden.

Aktivitäten/Methoden:

Insgesamt 423 Patientinnen und Patienten, davon 333 mit Verdacht auf Lungentumor und 90 COPD‐Kontrollen, wurden an zwei Standorten des Lungenkrebszentrums Bonn/Rhein‐Sieg in die Studie eingeschlossen. Von den Teilnehmenden wurden Blut‐ und Speichelproben gesammelt. Gewebeproben wurden im Rahmen von Operationen sowie Bronchoskopien gewonnen und im Rahmen der Studie histopathologisch befundet.

DNA‐Mutationen wurden per Next‐Generation‐Sequencing (NGS) im Gewebe sowie im Plasma identifiziert. Die im Plasma zirkulierende DNA wurde zusätzlich mit einer sensitiveren Methode (digital droplet PCR ‐ ddPCR) detektiert. Die epigenetischen Analysen von DNA‐Methylierung, RNA und Copy Number Variations (CNV) wurden anhand von Gewebeproben (OP‐Resektate sowie EBUS/PE‐Material aus Bronchoskopien), Vollblut‐, Plasma‐ und Speichelproben durchgeführt. Die Proteomanalysen erfolgten an Gewebe‐ und Plasmaproben. Die identifizierten Proteine wurden anschließend mittels verschiedener bioinformatischer Methoden ausgewertet. Weiterhin wurden die biospektroskopischen Gewebeanalysen um eine molekulare Erkennung des Mutationsstatus erweitert. Mittels Lasermikrodissektion wurden Tumorareale und gesunde Areale isoliert und für Proteom‐ und Mutationsanalysen zur Verfügung gestellt.

Ergebnisse:

Pathologie: Die Analyse der ctDNA aus den Plasmaproben zeigte keine ausreichende Detektion der DNA‐Mutationen (> 90 % Wildtyp) im Vergleich zu den gewebebasierten Analysen (< 10 % Wildtyp), auch nicht nach methodischen Umstellungen (Blutentnahmesystem, sensitivere ddPCR). Dies ist möglicherweise auf eine zu geringe Tumorlast bei frühen Tumorstadien (wenig ctDNA shedding) zurückzuführen.

Epigenetik: Verschiedene Marker auf der Ebene von DNA‐Methylierungen sowie die Auswertung von CNV ermöglichten eine hervorragende Differenzierung zwischen Tumor‐ und Nichttumorgewebe. Diese schloss auch kleinste Gewebemengen aus endobronchialen Ultraschall (EBUS) gestützten Biopsien mit ein. Eine Unterscheidung von Tumorerkrankten und Kontrollen anhand von Körperflüssigkeiten (Plasma, Speichel) mittels neu entwickelter Methoden zur DNA‐Methylierung war grundsätzlich möglich, jedoch konnte keine Differenzierung zwischen Tumor- und COPD‐Erkrankten erzielt werden. Letztere Limitation galt auch für RNA‐Marker. Jedoch konnten für bestimmte Subtypen (kleinzellige Lungentumoren) sowie bestimmte Markerkombinationen (miRNA + Protein) eine verbesserte Performance gegenüber den Einzelmarkern erzielt werden.

Biophysik: Die biospektroskopische Gewebeklassifikation aus dem Vorgängerprojekt (FP‐339) konnte verifiziert und die benötigte Messzeit durch den Einsatz von Quantenkaskadenlasern (QCL) auf wenige Minuten reduziert werden. Hiermit konnte nun eine Label‐freie molekulare Erkennung der Treibermutationen (TP53, KRAS, EGFR) etabliert werden, die auch auf molekularer Ebene die Label‐freie, automatisierte pathologische Subklassifizierung von Treibermutationen des Adenokarzinoms der Lunge mit hoher Sensitivität und Spezifität erlaubt.

Proteomics: Beim gewebebasierten Vergleich von Adenokarzinomen und Kontrollen mit benignen Lungenerkrankungen konnten Proteine identifiziert werden, die auch in den Plasmaproben differenziell nachweisbar waren. Durch Kombination aus Proteomics‐Analytik und bioinformatischen Ansätzen wurde anhand eines Teilprobensatzes ein Biomarkerpanel identifiziert, das mit einer Sensitivität von 97 % und einer Spezifizität von 89 % Adenokarzinome und COPD voneinander trennte. Die Verifizierung dieses Markerpanels wurde bisher noch nicht durchgeführt.

Schlussfolgerungen: Insgesamt konnten bisher noch keine Marker bzw. Markerkombinationen in Körperflüssigkeiten verifiziert werden, die für eine abschließende Validierung in einer Langzeitstudie zur Krebsfrüherkennung geeignet sind. Weitere Analysen sollen insbesondere neue Markerkombinationen sowie die Proteinmarker verifizieren, um die bisher nicht ausreichende Abgrenzung zu chronisch entzündlichen Lungenerkrankungen zu überprüfen.

Stand: