Identifizierung von Legionellen mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie

Status:

abgeschlossen 12/2007

Zielsetzung:

Ziel des Projektes war die Entwicklung einer Nachweismethode für Legionellen in Betriebsproben aus verschiedenen Arbeitsbereichen mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie als zeitsparende Alternative zu bestehenden Nachweisverfahren für den Einsatz im Messssystem der UV-Träger zur Gefährdungsermittlung - BGMG. Dazu sollten verschiedene fluoreszenzbasierte Methoden wie der Einsatz von Gensonden und verschiedenen Farbstoffen an Labor- und Betriebsproben getestet werden. Weiterführend sollte eine Standardisierung, Quantifizierung und Validierung der Methodik erfolgen.

Aktivitäten/Methoden:

Im ersten Teil des Projektes erfolgte der Aufbau eines Fluoreszenz-Arbeitsplatzes mit der notwendigen mikroskopischen Ausstattung im BGIA - Institut für Arbeitsschutz. Im weiteren Verlauf wurde die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) mit verschiedenen Oligonukleotid-Sonden zum Nachweis von Legionellen aus Umweltproben getestet. Die Grundlage hierfür bildeten die Ergebnisse eines Vorläuferprojektes, das in Zusammenarbeit mit dem Forschungszentrum Jülich durchgeführt und durch die Deutsche Gesetzliche Unfallversicherung gefördert wurde. Die im Projekt Nr. FFFF0202 "Legionellentest" entwickelte Hybridisierungstechnik sollte optimiert und damit die Bearbeitungszeit der Proben reduziert werden. Weiterhin sollte ein kommerziell erhältlicher Schnelltest zum Nachweis von Legionellen auf seine Einsetzbarkeit bei Betriebsproben getestet werden.

Ergebnisse:

Anhand der durchgeführten Untersuchungen konnte die Hybridisierungstechnik weiterentwickelt, die Bearbeitungszeit der Proben reduziert und die Qualität der fluoreszenzmikroskopischen Präparate verbessert werden. Der direkte Nachweis der Legionellen auf einem Filter und eine computerunterstützte Quantifizierung der Zellen konnte noch nicht als Standardverfahren zum Nachweis von Legionellen aus Betriebsproben beschrieben werden. Die Gründe dafür sind zum einen die Störanfälligkeit der Methodik gegenüber chemischen Substanzen in diesen Proben und zum anderen die hier meist in hohen Konzentrationen vorhandene mikrobiologische Begleitflora, die einen automatisierten Legionellennachweis mit dem Mikroskop erschwert. Eine computergestützte automatiserte Bildauswertung erfordert jedoch zunächst eine reproduzierbare Auswertung der einzelnen Mikroskopaufnahmen. Hier sind weitere Arbeiten erforderlich, um das Hybridisierungs- und Färbeprotokoll für verschiedene Proben zu optimieren.
Der getestete Schnelltest erfordert, wie das herkömmliche Nachweisverfahren nach DIN, eine Vorab-Anzucht von Einzelkolonien. Die Auswertung erfolgt mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie. Als Nachweisverfahren stellt er keine Verbesserung gegenüber dem etablierten Standandardverfahren dar (Kultivierung auf Selektivmedien und Nachweis mithilfe eines Latex-Agglutinationstestes), da das kommerzielleTestsystem mit dem Fluoreszenzmikroskop eine relativ aufwendige Laborausstattung und teure Testkits erfordert.

Stand: